赭曲霉毒素A快速檢測試劑盒

使用說明書

【產(chǎn)品簡介】

  赭曲霉毒素A是霉菌毒素，它具有很強(qiáng)的致癌性，主要存在于谷物、堅(jiān)果、棉籽以及一些和人類血液，動物飼料相關(guān)的產(chǎn)品中。其中赭曲霉毒素A的毒性、致癌性、污染頻率均居于首wei。薄層色譜一直是檢測赭曲霉毒素A常用的方法，但是此方法制備樣品及分析樣品時(shí)費(fèi)時(shí)又費(fèi)力。而使用赭曲霉毒素A ELISA試劑盒則能夠快速而準(zhǔn)確的分析樣品中赭曲霉毒素A殘留。

【測定原理】

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物赭曲霉毒素A和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭赭曲霉毒素A抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物赭曲霉毒素A的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較可得出相應(yīng)殘留物赭曲霉毒素A的含量。

【試劑盒技術(shù)指標(biāo)】   

規(guī)       格：96孔/盒

靈 敏 度：0. 1ppb

檢測時(shí)間： 75min

樣本檢測下限：

牛奶……………………………………………1ppb

奶粉、奶油、奶酪……………………………0.1ppb

飼料、谷物、玉米、花生、豆類……………10ppb

反應(yīng)率：

赭曲霉毒素A……………………………………100%

回收率：

食    品…………………………………………85±10%

飼    料…………………………………………75±10%

【試劑盒組成】   

1、 微量測試孔：（1X96孔板）每條8孔，一板12條

1、 標(biāo)準(zhǔn)液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb       高濃度標(biāo)準(zhǔn)品：×1瓶（1ml/瓶） 100ppb

2、 酶標(biāo)記物       12ml…………………………紅色帽

3、 抗體工作液     7ml…………………………綠色帽

4、 底物液 A液    7ml…………………………棕色帽

5、 底物液 B液    7ml…………………………黑色帽

6、 終 止 液          7ml…………………………黃色帽

7、 20X濃縮洗滌液40ml…………………… 白色帽

8、 2X濃縮復(fù)溶液50 ml…………………藍(lán)色帽

【所用儀器、試劑】   

儀          器：微孔板酶標(biāo)儀450nm/630nm、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀/

                     氮?dú)獯蹈裳b置、均質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、

                     刻度移液管、天平（感量0.01g ）

微量移液器：單道 20µl～200µl、100µl～1000µl、多道 250µl

試           劑：甲醇、正己烷、濾紙

【實(shí)驗(yàn)前溶液配制】

配液1、樣品提取液：70%甲醇溶液

        30ml蒸餾水或去離子水和70ml純甲醇混合制

         備70％甲醇溶液。

配液2、將1X復(fù)溶液將

2X濃縮復(fù)溶液用去離子水按照1：1稀釋（1 份濃縮樣品液

+1份去離子水）用于樣品的稀釋與復(fù)溶。

配液3、將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19

              稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量

              配制洗滌液。

【樣本前處理步驟】   

處理任何樣本時(shí)，都必須注意：

（a）實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時(shí)要更換吸頭。

（b）實(shí)驗(yàn)之前須檢查實(shí)驗(yàn)器具是否干凈，必要時(shí)可對實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

（a）生鮮牛奶；

     1、直接取50µl牛奶+450µl稀釋好的復(fù)溶液混合30s；

     2、取50µl用于檢測檢測分析。

          樣本稀釋倍數(shù):10

（b）奶粉、奶油、奶酪

1、稱取5g樣品于50ml離心管中，加入10ml甲醇，強(qiáng)力振蕩5min；室溫4000r/min以上，離心10min。

2、取2ml上清液，于50℃水浴中氮?dú)?/span>/空氣吹干。

3、用1ml正己烷溶解殘留物，加入1ml稀釋后的復(fù)溶液混合30s；室溫4000r/min以上，離心5min，

4、取50ul下層溶液進(jìn)行檢測分析。

     樣本稀釋倍數(shù):1

（C）飼料、谷物、玉米、花生、豆類

1、稱取2g粉碎的樣品于50ml離心管中，加入10ml 的提取溶液混合；強(qiáng)力振蕩5分鐘。

2、用Whatman No.濾紙過濾；收集過濾液。

3、取出上清液50ul與950ul 稀釋好的復(fù)溶液充分混合30s

      取50ul進(jìn)行檢測分析。

          樣本稀釋倍數(shù):100

【酶標(biāo)免疫分析程序】

操作步驟：

1、 將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、 按板架及需要取出微孔條，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

4、 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗體50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕震蕩混勻。25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。

5、 取出將孔內(nèi)液體甩干，用洗液250µl/孔洗板4-5次，每次間隔15-30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6、 每孔加入酶標(biāo)記物100µl，蓋板膜蓋板后置25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液充分洗，4-5遍（同上），用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

7、  顯色：每孔加入A液50µl，再加B液50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。

8、 測定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測,在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)）測定吸光度值（OD值）。

【結(jié)果判定】

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與赭曲霉毒素A的含量成負(fù)相關(guān)。

1、粗略判定：

用樣品的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出樣本所含沙丁胺醇濃度范圍（ng/ml）。假設(shè)樣品1的吸光度值為0.313，樣品2的吸光度值為1.032，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為1.892；0.1ppb為1.501；0.3ppb為1.175；0. 9ppb為0.751；2.7ppb為0.421； 8.1ppb為0.198。則樣品1的濃度范圍是2.7ppb-8.1ppb；樣品2的濃度范圍是0.3ppb-0.9ppb。乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中赭曲霉毒素A的實(shí)際含量。

2、定量判定：

所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值（B₀）再乘以100%，即百分吸光度值。

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中赭曲霉毒素A實(shí)際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣品的準(zhǔn)確、快速分析。

3、標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)曲線：

3、標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)曲線：

B/B0 (%)

0.1       0.3        0.9        2.7        8.1

赭曲霉毒素A (ppb) [µg/kg]

圖1：赭曲霉毒素A檢測試劑盒的回歸曲線

4、再現(xiàn)性：

%CV 

  0      0.1     0.3      0.9    2.7    8.1

赭曲霉毒素A (ppb) [µg/kg]

圖2：赭曲霉毒素A檢測試劑盒的精密度

由多個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定了精密度，圖2顯示出赭曲霉毒素A檢測試劑盒的精密度情況，獲得的標(biāo)準(zhǔn)吸收值的變異系數(shù)（%CV）對相應(yīng)赭曲霉毒素A濃度作曲線，可以看到在全部范圍內(nèi)變異系數(shù)如此之低，可以得到很好的再現(xiàn)性。

【注意事項(xiàng)】

1、 使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標(biāo)本沒有回到室溫（20-25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

3、 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、 不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進(jìn)自封袋密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個(gè)單位（A_450nm< 0.5 ）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。

8、 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

【儲存】

原包裝應(yīng)儲存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。

【有效期】有效期12個(gè)月;生產(chǎn)日期、有效期、批號見外包裝。